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Caracterización bioquímica de la GTPasa EFTUD1 y su interacción con la proteína SBSD mutada en el Síndrome Shwachman-Diamond

Instituto de Química, UNAM, Portal de Datos Abiertos UNAM, Colecciones Universitarias

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Instituto de Química, UNAM
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Dirección General de Asuntos del Personal Académico
Acervo
Colecciones Universitarias Digitales
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Dirección General de Repositorios Universitarios. contacto@dgru.unam.mx

Cita

Dirección de Desarrollo Académico, Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA). "Caracterización bioquímica de la GTPasa EFTUD1 y su interacción con la proteína SBSD mutada en el Síndrome Shwachman-Diamond", Proyectos Universitarios PAPIIT (PAPIIT). En "Portal de datos abiertos UNAM" (en línea), México, Universidad Nacional Autónoma de México.

Descripción del recurso

Título
Caracterización bioquímica de la GTPasa EFTUD1 y su interacción con la proteína SBSD mutada en el Síndrome Shwachman-Diamond
Colección
Proyectos Universitarios PAPIIT (PAPIIT)
Responsable
Nuria Victoria Sánchez Puig
Fecha
2010
Descripción
Los ribosomas son los componentes de las células que se encargan de las síntesis de proteínas. Constan de dos subunidades cuya composición es de 65% ARNr y 35% proteínas ribosomales. La biogénesis ribosomal ocurre en forma concertada en citoplasma y en núcleo(lo) de la células eucariontes, y requiere de la acción coordinada de más de 200 proteínas para su síntesis, procesamiento y ensamblaje. Además de su función como proteínas ribosomales y factores de procesamiento y ensamblaje, muchas de estas proteínas también juegan un papel como reguladores de la proliferación celular. De modo que su mal funcionamiento ocasiona el desarrollo de enfermedades que se han denominado como ribosomopatías. El estudio de estas ribosomopatías ha adquirido un gran auge recientemente como modelo para entender la relación entre el desarrollo de cáncer, en particular leucemia, y la síntesis de ribosomas. Dentro de estas enfermedades se encuentra el Síndrome Shwachman-Diamond que se caracteriza por anormalidades óseas, insuficiencia pancreática, neutropenia y predisposición a desarrollar leucemia. El gen SBDS, mutado en esta enfermedad, codifica para una proteína altamente conservada en archaea y eucariontes. Gracias a esta conservación evolutiva los primeros indicios de su función molecular han sido obtenidos usando el ortólogo de levadura, Sdo1. La proteína Sdo1 parece ser una proteína accesoria de la biogénesis ribosomal que recluta a la GTPasa Efl1 a la superficie de la subunidad ribosomal 60S para promover, mediante la hidrólisis de GTP, la disociación del factor de anti-asociación Tif6 y permitir el ensamblaje del ribosoma. Durante mi estancia post-doctoral logré identificar, por primera vez, la interacción entre Efl1 y Sdo1. Se pudo establecer que residuos equivalentes a los mutados en pacientes con la enfermedad participan directamente en esta interacción. Estudios de RMN sugieren que el dominio II de Sdo1 es quien participa en la interacción con Efl1 (manuscrito en preparación). Debido a lo anterior, es probable que uno de los mecanismos de la enfermedad se deba a la pérdida de la interacción entre éstas dos proteínas con el consecuente reciclaje inadecuado de factores que participan en la maduración ribosomal. Efl1 y su contraparte humana, EFTUD1, son proteínas homóloga a las translocasas ribosomales EF-G/EF-2 cuya organización estructural conserva muchas de las características de esta familia de proteínas, tales como el dominio G, que esta involucrado en la unión e hidrólisis de GTP. Efl1 es una proteína citoplásmica que no se encuentra asociada a ninguna partícula ribosomal, sin embargo su actividad enzimática se ve estimulada por la subunidad ribosomal 60S [1]. Por lo que no es claro si Sdo1 simplemente recluta a Efl1 a la subunidad 60S ó si Sdo1 estimula su actividad enzimática. Estudios de doble híbrido sugieren que los residuos 1-670 correspondientes al dominio I y II de Efl1, son los que participan en la interacción con el dominio II de Sdo1 (datos no publicados). Más aún, en humanos existen dos isoformas de la proteína EFTUD1 que se distinguen por una deleción de 51 residuos. Esta deleción se encuentra en el dominio I y coincide tanto con el sitio de interacción de factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF, por sus siglas en inglés, guanine exchange factor) como con la región G1 y G2 quienes están involucradas en la unión de GTP. Debido a lo anterior es probable que las dos isoformas de EFTUD1 tengan actividades intrínsecas diferentes. Será interesante caracterizar la interacción entre SBDS y EFTUD1, y evaluar si la interacción con SBDS modifica la actividad de GTPasa de EFTUD1. Esto será de gran importancia para entender la contribución molecular de estas dos proteínas en la biogénesis ribosomal y en el desarrollo del Síndrome Shwachman-Diamond. Estudios de complementación genética para la familia de proteínas SBDS, demostró que la conservación funcional de estas proteínas es casi inexistente, ya que sólo el homólogo de Schizosaccharomyces pombe es capaz de complementar a células de S. cerevisiae sdo1Δ [2]. Esto resulta interesante a la luz de que las estructuras de las proteínas SBDS de diferentes ortólogos es muy similar ([3] y comunicación personal C. Hilcenko). Puesto que las proteínas Sdo1 y Efl1 interaccionan físicamente y parecen participan conjuntamente en la misma ruta celular, se estudiará si existe una conservación funcional en la familia de las proteínas Efl1/EFTUD1 mediante estudios de complementación genética en células de S. cerevisiae efl1Δ. Se estudiará también la posibilidad de que la función de las proteínas SBDS/EFTUD1 hayan co-evolucionado de tal forma que funcionen como un par ortogonal y que al evaluarse en forma individual la conservación funcional es baja pero en forma conjunta es alta._x000D_ Si bien los estudios realizados con las proteínas ortólogas de levadura, Sdo1 y Efl1, han sido útiles en el conocimiento de este sistema, es importante trabajar con las proteínas humanas (SBSD y EFTUD1) pues son éstas las que reflejarán en forma adecuada su función en la biogénesis ribosomal y en el desarrollo de la enfermedad Shwachman-Diamond. Para abundar en la inter-relación y función de las proteínas SBDS y EFTUD1, asi como su impacto en los procesos antes mencionados, se plantean los siguientes experimentos:_x000D_ _x000D_ - Se realizará un estudio comparativo de la interacción entre las dos isoformas de EFTUD1 con la SBDS silvestre y mutantes asociadas a la enfermedad. La interacción proteína-proteína se cuantificará mediante fluorescencia anisotrópica en la que se seguirán los cambios en la señal de fluorescencia del reactivo FlAsH™ (4',5'-bis(1,3, 2-dithioarsolan-2-yl)fluorescein). Este reactivo es un compuesto bi-arsénico que al unirse en forma específica a secuencias CCXXCC exhibe una fluorescencia característica [4]._x000D_ _x000D_ - Posteriormente se determinará la actividad enzimática de ambas isoformas de EFTUD1 y una vez obtenidas las constantes cinéticas de las enzimas silvestres se estudiará si la SBDS funciona como una proteína GEF para lo cual se evaluará si los parámetros cinéticos de EFTUD1 son alterados por la proteína SBDS. _x000D_ _x000D_ - Debido a que la regulación de la biogénesis ribosomal mediada por EFTUD1 puede deberse no sólo a diferencias en la actividad de sus isoformas, si no también a diferencias en el nivel expresión de dichas proteínas, se evaluará la expresión de los correspondientes ARNm en diferentes tejidos adultos y fetales mediante PCR de transcripción reversa._x000D_ _x000D_ - Finalmente, para entender en detalle la conservación funcional de la familia de proteínas EFTUD1 y aprovechando la naturaleza esencial del gen efl1 en levadura, se llevarán a cabo estudios de complementación genética. Se evaluará si los genes correspondientes a las isoformas humanas EFTUD1 o genes ortólogos de diversos organismos son capaces de recuperar la letalidad observada en células efl1Δ. Se evaluará también si las proteínas EFTUD1 y SBDS trabajan como un par ortólogo y pueden complementar células que contengan la doble deleción efl1Δ/ sdo1Δ._x000D_
Tema
Estructura y función de proteínas; Bioquímica
Identificador global
http://datosabiertos.unam.mx/DGAPA:PAPIIT:IN204010

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